Macchiatura occidentale delle proteine
Macchiatura occidentale delle proteine!
Le proteine vengono denaturate mediante incubazione con un detergente ionico (SDS: sodio dodecil solfato) a 100 ° C.
SDS ricopre uniformemente tutte le proteine e rende la carica superficiale delle proteine negativa.
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La proteina denaturata viene quindi elettroforizzata in gel di poliacrilammide. Le proteine vengono separate come bande distinte in base al loro peso molecolare.
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Le proteine separate sono alleate elettroforetiche trasferite su una carta da filtro (nylon o nitrocellulosa).
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La carta da filtro viene quindi incubata con antisieri contro le proteine. Gli anticorpi si legano ai corrispondenti antigeni proteici sulla carta da filtro e formano complessi antigene-anticorpo.
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La carta da filtro viene lavata per rimuovere i componenti del siero non legati.
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L'anti-immunoglobulina marcata con enzima (nota come coniugato) viene aggiunta alla carta da filtro e incubata.
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Il coniugato si lega all'anticorpo nel complesso antigene-anticorpo nella carta da filtro.
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La carta da filtro viene lavata per rimuovere il coniugato non legato e il substrato viene aggiunto e incubato.
io. Le bande colorate si sviluppano nei luoghi in cui sono presenti complessi antigene-anticorpo.
iii. Il mancato sviluppo della banda suggerisce che il corrispondente anticorpo contro l'antigene sia assente nel siero del test.
Le carte filtro impregnate di antigeni possono essere conservate per periodi più lunghi.
Il saggio Western blot è ampiamente utilizzato per rilevare gli anticorpi del virus dell'epatite C e come test di conferma per l'individuazione di anticorpi contro il virus dell'immunodeficienza umana (HIV).
Le compagnie commerciali impregnano carte filtranti con antigeni HIV separati e forniscono ai laboratori. In laboratorio, il siero del paziente viene aggiunto alla carta da filtro e processato per rilevare la presenza di anticorpi specifici contro l'HIV nel siero.
radioimmunologico:
Il saggio radioimmunologico (RIA) fu sviluppato per la prima volta da Rosalin Yalow e Berson (1959). Sono state introdotte numerose varianti del metodo. Esistono due principali tecniche RIA, RIA competitiva e RIA non competitiva.
Diversi radioisotopi sono usati come etichette (Tabella 27.4) e le emissioni radioattive sono misurate in termini di conteggi al minuto (CPM) usando il contatore di scintillazione. L'etichetta più popolare, 125 I, richiede un tempo più breve per il conteggio dei segnali, ma ha una durata limitata a causa della sua breve emivita. Il radioisotopo di trizio ( 3 H) richiede un tempo maggiore per il conteggio e quindi il tempo totale di analisi viene aumentato.
I vantaggi di RIA sono:
io. Precisione e alta qualità
ii. La coniugazione isotopica è facile
iii. Rilevamento del segnale senza ottimizzazione
Tabella 27.4: Proprietà dei radioisotopi utilizzati nel dosaggio radioimmunologico:
Isotopo | Metà vita | Tipo di decadimento | Attività specifica (mCi / μmol) |
125 I | 60 giorni | γ | 2200 |
131 I | 8, 1 giorni | Β-, γ | 16.100 |
3 H | 12, 3 anni | β- | 29 |
14 C | 5760 anni | β- | 6062 |
32 p | 14, 3 giorni | β- | 9120 |
Tuttavia, RIA presenta i seguenti svantaggi
io. Breve emivita dei reagenti
ii. Pericoli di radioattività.
