Immunodiffusione di antigene o anticorpi

Immunodiffusione di antigene o anticorpi!

Immunodiffusione si riferisce al movimento di antigene o anticorpo o di entrambe le molecole di antigene e anticorpi in un mezzo di supporto per diffusione.

L'antigene e l'anticorpo si legano l'uno con l'altro e formano l'immuno-precipitato insolubile, che è visibile ad occhio nudo come banda o linea precipitina. J. Oudin ha descritto un sistema di diffusione singola di antigene e anticorpo in provette riempite di agar.

Presto Ouchterlony descrisse una doppia diffusione in agar, stratificata su vetrini. Il movimento è anche descritto come lineare o radiale. I metodi di immunodiffusione sono utilizzati per l'analisi qualitativa e quantitativa delle proteine ​​del siero. Tuttavia metodi più sensibili e specifici come il test immunoassorbente legato agli enzimi (ELISA) e il test radioimmunologico (RIA) hanno quasi sostituito i metodi di immunodiffusione.

Immunodiffusione singola:

Sia l'antigene che l'anticorpo rimangono fissi e gli altri reagenti si muovono (tecnica di diffusione di Oudin).

Doppia Immunodiffusione:

Sia l'antigene che l'anticorpo sono liberi di muoversi l'uno verso l'altro. (Tecnica di Ouchterlony).

L'agar fuso viene versato su vetrino o petridish e lasciato solidificare. Due piccoli pozzetti a pochi millimetri di distanza sono punzonati. L'antigene e le corrispondenti soluzioni anticorpali vengono rilasciati in pozzetti opposti. Il vetrino / petridi viene quindi tenuto in una camera umida per 18-24 ore. L'antigene e l'anticorpo si muovono attraverso l'agar e si combinano per formare un complesso antigene-anticorpo. Il complesso antigene-anticorpo è visibile come una linea di precipitazione.

La doppia diffusione viene eseguita anche posizionando pozzetti antigene e anticorpo a vari angoli per scopi comparativi. I tre modelli di queste reazioni sono mostrati nella Figura 27.2.

io. Reazione dell'identità:

Gli antigeni in due pozzetti sono identici (Agl e Ag2). Quindi la reazione con l'anticorpo si traduce in linee di precipitina esattamente simili. Le linee di precipitina non si incrociano, ma formano una linea continua. La fusione delle due linee di precipitina indica che l'anticorpo sta reagendo con epitopi comunemente presenti sui due antigeni.

ii. Reazione della non identità:

Due antigeni non identici (Agl e Ag3) si trovano nei pozzetti antigeni mentre il pozzetto anticorpale ha anticorpi contro entrambi gli antigeni. Le due linee di precipitina antigene-anticorpo formate differiscono l'una dall'altra. Quindi le due linee di precipitina si incrociano completamente (si intersecano) l'una con l'altra.

iii. Reazione dell'identità parziale:

I determinanti antigenici negli antigeni di due pozzetti sono parzialmente condivisi (Agl e Agla). Quindi l'anticorpo reagisce sia con gli antigeni che con le linee di forme che non formano una croce completa. La linea precipitina attraversa in una sola direzione. La linea di precipitina estesa è indicata come uno sperone. Lo sperone indica che l'anticorpo sta anche precipitando un epitopo addizionale che non è presente in uno degli antigeni.

La doppia immunodiffusione può anche essere utilizzata per l'analisi semiquantitativa dell'antigene o dell'anticorpo (Figura 27.3):

Fig. 27.3:

Doppia immunodiffusione per analisi semiquantitativa dell'antigene. L'anticorpo viene posto nel pozzetto centrale e l'antigene viene posto in concentrazioni diverse nei pozzetti periferici

io. Quantificazione dell'antigene:

L'antigene X è diluito in serie e posto nei pozzetti che circondano un pozzetto centrale in cui è posto l'anticorpo anti-X. L'antigene e l'anticorpo si diffondono fuori dai pozzetti e reagiscono l'uno con l'altro, determinando la formazione di linee di precipitina tra i pozzetti dell'antigene e dell'anticorpo. La quantità di precipitato antigene-anticorpo diminuisce con la diminuzione delle quantità di antigeni nei diversi pozzetti. Pertanto, lo spessore delle linee di precipitina diminuisce al diminuire delle concentrazioni di antigene.

ii. Quantificazione dell'anticorpo:

Viene utilizzata una procedura simile alla quantificazione dell'antigene, con la differenza che la posizione dell'antigene e dell'anticorpo sono cambiate. L'antigene è posto nel pozzetto centrale e l'anticorpo a diverse diluizioni è posto nei pozzetti esterni.

Immunodiffusione radiale singola:

Mancini ha introdotto questa nuova tecnica per la quantificazione accurata degli antigeni. L'anticorpo viene miscelato con agar fuso e versato in una capsula di Petri. Dopo la solidificazione dell'agar, i pozzetti vengono tagliati e riempiti con diverse concentrazioni di antigene (Fig. 27.4).

L'antigene si diffonde fuori dal pozzo e forma il precipitato complesso antigene-anticorpo in 48-72 ore. Il precipitato è visto come una linea circolare bianca attorno ad ogni pozzo. Il diametro dell'anello circolare è direttamente proporzionale alla concentrazione dell'antigene (cioè, più la concentrazione dell'antigene, il diametro del precipitato è più).

Una curva standard può essere tracciata in un foglio grafico tracciando le concentrazioni di antigene note nell'asse X e i diametri nell'asse Y. L'antigene di prova, la cui concentrazione è sconosciuta, può essere determinato interpolando la curva standard con il diametro del precipitato formato dall'antigene di prova.

La sensibilità di questo metodo è 1-3 μg / ml di antigene. Questo metodo viene utilizzato per quantificare le concentrazioni di IgG, IgM o IgA (incorporando negli agar anti-IgG, anti-IgM o anti-IgA antisera, rispettivamente).