Esperimento per eseguire colorazione Gram dei batteri (con figura)

Leggi questo articolo per conoscere l'esperimento per eseguire la colorazione del grammo dei batteri per scoprire se è gram-positivo o gram-negativo!

Scopo:

La più importante colorazione differenziale utilizzata in microbiologia è la colorazione del grammo.

Prende il nome dal Dr. Christian Gram che ha classificato i batteri, in base alle differenze nella composizione della loro parete cellulare, in due gruppi come segue:

(1) batteri Gram-positivi:

Dopo aver colorato un batterio con il cristal violetto, se la sua parete cellulare resiste alla decolorazione lavando con un agente decolorante (etanolo o acetone), si tratta di un batterio gram-positivo. Esempi: Bacillus, Staphylococcus.

(2) batteri Gram-negativi:

Dopo aver colorato un batterio con il cristal violetto, se la sua parete cellulare permette di essere sottoposto a decolorazione mediante lavaggio con un agente decolorante (etanolo o acetone), si tratta di un batterio gram-negativo. Esempi: Escherichia, Salmonella, Vibrio.

La differenziazione dei batteri in gruppi gram-positivi e gram-negativi fornisce l'indizio più importante per procedere ulteriormente nella direzione corretta per l'identificazione di batteri sconosciuti. È anche utile per la semplice differenziazione dei batteri nei gruppi gram-positivi e gram-negativi. Dà anche un'idea sulla forma e la disposizione delle cellule batteriche.

Principio:

Nella colorazione del grammo, le cellule batteriche vengono prima macchiate con una macchia primaria, il cristal violetto che penetra nelle cellule e le macchia di viola-blu. Quindi, le cellule vengono trattate con un mordente, iodio di grammo, che penetra nelle cellule e si lega alla macchia primaria formando un complesso di mordente colorante insolubile (complesso di cristalli di iodio-violetto), rendendo così difficile la fuga della macchia.

Quindi, le cellule vengono trattate con un agente decolorante, come etanolo o acetone. Agisce come solvente lipidico e come agente disidratante. Nelle cellule gram-positive, l'agente decolorante agisce inizialmente come un solvente lipidico, dissolvendo la piccola quantità di lipide presente nella parete cellulare, formando in questo modo minuscoli pori. Successivamente, disidrata le proteine ​​della parete cellulare (peptidi), che chiudono i pori.

Ora, il complesso macchia-mordente è difficile da rimuovere dall'agente decolorante e le cellule mantengono il colore viola-blu della macchia primaria. Quando è contro-macchiato da una macchia di colore rosa-rosso, safranin, non può entrare nelle cellule, poiché i pori sono stati chiusi.

Le cellule mantengono infine il colore viola-blu della macchia primaria. D'altra parte, la parete cellulare gram-negativa contiene una grande quantità di lipidi (LPS), che viene dissolta dall'agente decolorante, con conseguente formazione di pori dilatati. Questi pori non si chiudono in modo apprezzabile sulla disidratazione delle proteine ​​della parete cellulare.

È per questo; il complesso macchia-mordente sfugge attraverso i pori, quando viene lavato dall'agente decolorante e le cellule appaiono incolori. Quando è contro-macchiato dal safranin, penetra nelle cellule attraverso i pori e infine le cellule assumono il colore rosa-rosso della controcolora.

Materiali richiesti:

Diapositiva, cappio, macchia primaria (cristallo viola), mordente (iodio di grammo), agente decolorante (etanolo al 95%), contro-macchia (safranina), brodo / inclinazione / coltura della piastra di batteri, microscopio, olio per immersione.

Procedura:

1. Un vetrino viene pulito correttamente sotto l'acqua del rubinetto, in modo che l'acqua non rimanga come gocce sulla sua superficie (Figura 5.11).

2. L'acqua aderente viene eliminata con carta bibula e il vetrino viene asciugato all'aria.

3. Uno striscio di batteri viene preparato al centro della diapositiva in due modi come segue.

(un) Se si osserva un batterio cresciuto su piastra di agar o inclinazione dell'agar, una goccia d'acqua viene posta al centro della diapositiva e un anello di batteri dalla piastra o dall'inclinazione viene trasferito su di esso da un ciclo sterilizzato su fiamma. Quindi, mediante una lenta rotazione del cappio nella goccia, viene fatta una sospensione batterica che viene dispersa fino a ottenere uno striscio.

(B) Se un batterio cresciuto in un brodo liquido deve essere osservato, una goccia della sospensione di batteri viene posizionata direttamente al centro del vetrino da un cappio sterilizzato dalla fiamma e viene fatto uno striscio diffondendolo.

4. La macchia è asciugata all'aria.

5. Lo striscio è fissato dal riscaldamento. Il riscaldamento si traduce in coagulazione delle proteine ​​cellulari, a causa delle quali le cellule si attaccano alla superficie del vetrino e non vengono lavate via durante la colorazione, la fissazione del calore avviene facendo passare rapidamente il vetrino sopra una fiamma 2-3 volte, con lo striscio superficie rivolta verso l'alto, in modo che lo striscio non si riscaldi.

6. Il vetrino viene tenuto su un vassoio di colorazione e inondato con la macchia primaria, viola di cristallo, per 1 minuto.

7. L'eccesso di macchie viene lavato via dallo striscio sotto l'acqua del rubinetto che scorre dolcemente, in modo tale che l'acqua non cada direttamente sullo striscio.

8. La macchia è inondata dal mordente, iodio di grammo, per 1 minuto.

9. L'eccesso di mordente viene lavato via dallo striscio sotto l'acqua del rubinetto che scorre dolcemente, in modo tale che l'acqua non cada direttamente sullo striscio.

10. Lo striscio viene inondato con l'agente decolorante, al 95% di etanolo, per 5 secondi, facendo attenzione, in modo che lo striscio non sia troppo decolorato.

11. L'etanolo viene rapidamente lavato via dallo striscio sotto l'acqua del rubinetto che scorre dolcemente, in modo da evitare la decolorazione eccessiva. Si fa attenzione, in modo che l'acqua non cada direttamente sullo striscio.

12. Lo striscio viene inondato con la contro-macchia, safranina, per 1 minuto.

13. La contro-macchia in eccesso viene lavata via dallo striscio sotto l'acqua del rubinetto che scorre dolcemente, in modo tale che l'acqua non cada direttamente sullo striscio.

14. Il vetrino viene asciugato con carta bibula.

15. La diapositiva viene agganciata allo stadio del microscopio e lo striscio viene osservato in caso di obiettivi a bassa potenza e alto secco.

16. Una goccia di olio per immersione viene applicata allo striscio.

17. Lo striscio è osservato sotto l'obiettivo di immersione dell'olio.

Osservazioni (sotto l'obiettivo di immersione in olio):

1. Colore delle celle:

Viola-blu: batteri Gram-positivi

Rosa-rosso: batteri Gram-negativi

2. Forma dei batteri:

Sferico (coccus)

A forma di bastoncello (bacilli)

Simile a virgola (vibrione)

Spirale (spirochete)

3. Disposizione dei batteri:

Coppie (diplobacillus / diplococcus)

A quattro (tetradi)

In catene (streptococco / streptococco)

Grappoli d'uva (staphylococcus)

Cuboidal (sarcinae o ottetto)

4. Dimensione dei batteri:

Con la stima dell'occhio, fai il disegno del campo sotto l'obiettivo di immersione in olio.

Reazione Gram-variabile:

In alcuni casi, le cellule gram-positive appaiono come cellule gram-negative. Questo è chiamato reazione gram-variabile.

Le ragioni sono le seguenti:

(a) Può verificarsi sovra-decolorazione, a causa della quale anche le cellule gram-positive perdono il loro colore violetto.

(b) Può verificarsi una fissazione eccessiva, a causa della quale le cellule gram-positive perdono la capacità di resistere alla decolorazione

(c) Se si utilizza una vecchia coltura di batteri, i componenti della parete cellulare possono cambiare con l'età delle cellule consentendo la decolorazione.