Test di Deoxyribonuclease sui batteri per scoprire le loro capacità di idrolizzare il DNA (con la figura)

Test deossiribonucleasi (test DNase) sui batteri per scoprire le loro capacità di idrolizzare il DNA (con la figura)!

Principio:

Alcuni batteri hanno la capacità di idrolizzare l'acido desossiribonucleico (DNA) in oligonucleotidi, poiché possono produrre l'enzima idrolizzato extracellulare "deossiribonucleasi" (DNasi).

Mentre il DNA viene precipitato dall'acido cloridrico producendo opacità, i suoi prodotti finali idrolizzati, gli oligonucleotidi, non vengono precipitati dall'acido cloridrico, per il quale non producono tale opacità; piuttosto produrre trasparenza.

Nel test DNase, i batteri test vengono coltivati su piastre di agar contenenti DNA. Dopo che le colonie dei batteri sono visibili, le piastre sono inondate di acido cloridrico. Se i batteri hanno la capacità di idrolizzare il DNA, le sue colonie idrolizzano il DNA nel terreno nelle aree circostanti, mentre il resto delle aree contiene DNA non idrolizzato.

Di conseguenza, quando sono inondati di acido cloridrico, intorno alle colonie si formano zone trasparenti trasparenti, poiché i prodotti idrolizzati, gli oligonucleotidi, formati attorno a loro non formano precipitati con l'acido cloridrico.

D'altra parte, il resto delle aree delle piastre diventa opaco, poiché il DNA non idrolizzato in queste aree forma precipitati con l'acido cloridrico. Se si usa il blu di toluidina invece dell'acido cloridrico, si produce un alone rosa rosa solo attorno alle colonie.

Materiali richiesti:

Piastre di Petri, matraccio conico, tappi di cotone, ansa da inoculo, autoclave, becco Bunsen, camera a flusso laminare, vasetto di raccolta, incubatore, agar DNase, acido cloridrico (o blu di toluidina 0, 1%), colonie isolate o colture pure di batteri.

Procedura:

1. Due piatti di Petri vengono puliti, coperti con carta artigianale e legati con filo o elastico (Figura 7.23). Questo passaggio e la sterilizzazione delle piastre di Petri nella fase 6 sono omessi, se le piastre di Petri sterilizzate a forno vengono utilizzate direttamente.

2. Gli ingredienti del terreno dell'agar DNase (contenente il DNA come componente principale) o la sua polvere pronta per l'uso richiesta per 100 ml del terreno vengono pesati e sciolti in 100 ml di acqua distillata in una beuta da 250 ml agitandoli e agitandoli.

3. Il suo pH è determinato usando una carta pH o un pH metro e regolato a 7, 2 usando HCI 0, 1 N se è maggiore o usando 0, 1 N NaOH se è inferiore.

4. Il pallone viene riscaldato per sciogliere completamente l'agar nel terreno.

5. Il matraccio è tappato in cotone, coperto con carta artigianale e legato con filo o elastico.

6. Le due capsule di Petri e il matraccio conico contenente terreno dell'agar DNase vengono sterilizzati a 121 ° C (15 psi di pressione) per 15 minuti in un'autoclave.

7. Dopo la sterilizzazione, vengono rimossi dall'autoclave e lasciati raffreddare per un po 'di tempo, senza consentire al terreno di solidificarsi. Il raffreddamento del mezzo impedisce la formazione di condensa e l'accumulo di gocce d'acqua all'interno delle piastre. Se il terreno è già stato preparato e solidificato durante lo stoccaggio, deve essere liquefatto riscaldando accuratamente finché non si scioglie completamente.

8. Per preparare le piastre di agar DNase, prima che il terreno dell'agente DNase sterilizzato si raffreddi e si solidifichi, in condizioni di fuso caldo, viene versato in modo asettico, preferibilmente all'interno di una camera a flusso laminare, nelle due piastre di Petri sterilizzate (circa 20 ml ciascuna), in modo che il mezzo fuso copre completamente il fondo delle piastre di Petri.

Quindi, le piastre sono coperte con i loro coperchi e lasciate raffreddare, in modo da solidificare il mezzo in esse. Il vapore acqueo che può condensare sulla superficie interna delle piastre e dei coperchi viene evaporato mantenendo le piastre e i coperchi in posizione capovolta in un incubatore a 37 ° C per circa 1 ora.

9. Ogni piatto è segnato sul lato inferiore in quattro quarti.

10. L'inoculazione spot dei batteri di prova viene eseguita in modo asettico, preferibilmente all'interno di una camera a flusso laminare, al centro di ogni quarto facendo uno spot (o piccolo striscio) dei batteri con l'aiuto di un'ansa ignifuga. Il ciclo è sterilizzato dopo ogni inoculazione.

11. Le piastre inoculate vengono incubate in posizione capovolta, dall'alto verso il basso, a 37 ° C per 24-48 ore in un incubatore fino a quando le colonie dei batteri sono visibili.

12. Le piastre sono allagate con una soluzione di acido cloridrico 1 N (o blu di toluidina allo 0, 1%).