Metodi biologici di valutazione della droga

Quando i metodi fisici o chimici di valutazione o la quantità di campione sono molto meno non sono in grado di produrre risultati soddisfacenti nei farmaci, i farmaci vengono valutati con metodi biologici di valutazione. Questi metodi sono eseguiti sugli animali viventi, isolando l'organo vivente e il tessuto, la preparazione degli animali e il microrganismo. I metodi biologici di valutazione vengono eseguiti sull'organismo vivente sono chiamati saggio biologico o saggio biologico.

Il seguente metodo è usato come:

1. Attività anti-infiammatoria di farmaci

2. Attività antipiretica di droghe

3. Attività antidiabetica dei farmaci

4. Attività analgesica dei farmaci

5. Attività antiulcera dei farmaci

6. Attività antielmintica del farmaco: vengono eseguite su vermi di terra

7. Attività cardiaca di una preparazione: i glycosides cardiaci sono valutati su rana e piccione

8. Metodi microbiologici: i batteri viventi, i lieviti e le muffe sono utilizzati per il dosaggio delle vitamine e per determinare l'attività dei farmaci antibiotici.

Attività antinfiammatoria di una preparazione:

Zampa edema metodo:

Si utilizzano ratti Sprague-Dawley maschi o femmine con un peso corporeo compreso tra 100 e 150 g. Gli animali sono affamati durante la notte. Per assicurare un'idratazione uniforme, i ratti ricevono 5 ml di acqua mediante tubo gastrico (controlli) o il farmaco in esame disciolto o sospeso nello stesso volume. Trenta minuti dopo, i ratti sono sfidati da un'iniezione sottocutanea di 0, 05 ml di soluzione all'1% di carrageen an nel lato plantare della zampa posteriore sinistra. La zampa è contrassegnata con inchiostro a livello del malleolo laterale e immersa nel mercurio fino a questo segno.

Il volume della zampa viene misurato pletismograficamente immediatamente dopo l'iniezione, ancora 3 e 6 ore, e alla fine 24 ore dopo la prova. L'aumento del volume della zampa dopo 3 o 6 ore viene calcolato come percentuale rispetto al volume misurato immediatamente dopo l'iniezione dell'irritante per ciascun animale.

Gli animali trattati in modo efficace mostrano molto meno edema. La differenza dei valori medi tra animali trattati e gruppi di controllo viene calcolata per ciascun intervallo di tempo e valutata statisticamente. Le differenze ai vari intervalli di tempo danno alcuni suggerimenti per la durata dell'effetto anti-infiammatorio. Viene eseguita una curva dose-risposta per i farmaci attivi e si possono determinare i valori di ED ₅₀ .

Metodo del granuloma di lana di cotone:

Ratti maschi Wister con un peso medio di 200 g sono anestetizzati con etere. La pelle posteriore è rasata e disinfettata con etanolo al 70%. Un'incisione è fatta nella regione lombare. Con una pinza smussata si formano tunnel sottocutanei e un pellet di cotone sterilizzato viene posto su entrambi i lati nella regione scapolare.

I pellet sono standardizzati per l'uso in odontoiatria del peso di 20 mg o pellet formato da cotone grezzo, che producono un'infiammazione più pronunciata rispetto al cotone sbiancato. Gli animali vengono trattati per 7 giorni per via sottocutanea o orale.

Quindi, gli animali vengono sacrificati, i pellet preparati ed essiccati fino a che il peso rimane costante. Il peso secco netto, cioè dopo aver sottratto il peso del pellet di cotone è determinato. Viene calcolato il peso medio del pellet del gruppo di controllo e del gruppo di test. Viene determinata la variazione percentuale del peso del granuloma rispetto al gruppo di controllo del veicolo.

Attività antipiretica di una preparazione:

Si possono usare conigli di entrambi i sessi e di vari ceppi con un peso corporeo compreso tra 3 e 5 kg. Gli animali vengono posti in gabbie adeguate e le termocoppie collegate con un registratore automatico vengono introdotte nel retto. Gli animali sono autorizzati ad adattarsi alle gabbie per 60 minuti.

Quindi vengono iniettati per via endovenosa nell'orecchio di coniglio 0, 2 ml / kg contenenti 0, 2 μg di lipopolisaccaride. Sessanta minuti dopo, il composto in esame viene somministrato per via sottocutanea o orale. La temperatura corporea viene monitorata per almeno 3 ore.

Una diminuzione della temperatura corporea per almeno 0, 5 ° C per più di 30 minuti rispetto al valore della temperatura prima della somministrazione del composto in esame è considerata come un effetto positivo. Questo risultato è stato trovato dopo 45 mg / kg di fenilbutazone sottocutaneo o 2, 5 mg / kg di indometacina sottocutanea.

Attività antidiabetica di farmaci:

Diabete indotto da Streptozotocina:

Ratti maschi Wister del peso di 150-220 g alimentati con una dieta standard vengono iniettati per via endovenosa con 60 mg / kg di streptozotocina (Calbiochem). Come con l'allossano, si osservano tre fasi delle variazioni di glucosio nel sangue. Inizialmente, la glicemia aumenta, raggiungendo valori di 150-200 mg% dopo 3 ore. Sei-otto ore dopo la streptozotocina, i valori di insulina sierica sono aumentati fino a 4 volte, risultando in una fase ipoglicemica, seguita da iperglicemia persistente. La gravità e l'insorgenza dei sintomi diabetici dipendono dalla dose di streptozotocina.

Dopo la dose di 60 mg / kg per via endovenosa. I sintomi si verificano già dopo 24-48 ore con iperglicemia fino a 800 mg%, glucosuria e chetonemia. Istologicamente, le cellule beta sono degranulate o addirittura necrotiche. Uno stato stazionario viene raggiunto dopo 10-14 giorni consentendo l'utilizzo degli animali per i test farmacologici.

Diabete indotto dallo alloxan: Conigli che pesano tra 2, 0 e 3, 5 kg vengono infusi attraverso la vena dell'orecchio con 150 mg / kg di alloxan monoidrato (5, 0 g / 100 ml, pH 4, 5) per 10 min, con il risultato che il 70% degli animali diventa iperglicemico e uricosurico. Il resto degli animali muore o è solo temporaneamente iperglicemico.

Attività analgesica di una preparazione:

Metodo piastra calda:

Per ogni dose vengono utilizzati gruppi di 10 topi di entrambi i sessi con un peso iniziale di 18-22 g. La piastra riscaldante, che è disponibile in commercio, consiste in una superficie riscaldata elettricamente. La temperatura è controllata da 55 ° a 56 ° C. Questo può essere una piastra di rame o una superficie di vetro riscaldata. Gli animali sono posizionati sulla piastra riscaldante e il tempo fino a quando non avviene leccare o saltare è registrato da un cronometro. La latenza viene registrata prima e dopo 20, 60 e 90 minuti dopo la somministrazione orale o sottocutanea dello standard o del composto del test.

Test di immersione di coda:

Vengono utilizzati ratti Wister femmina (170-210 g di peso corporeo). Sono collocati in gabbie di contenimento individuali che lasciano la coda appesa liberamente. Gli animali sono autorizzati ad adattarsi alle gabbie per 30 minuti prima del test. La porzione inferiore di 5 cm della coda è contrassegnata. Questa parte della coda è immersa in una tazza di acqua appena riempita di esattamente 55 ° C. Entro pochi secondi il topo reagisce ritirando la coda. Il tempo di reazione viene registrato in unità di 0, 5 s da un cronometro. Dopo ogni determinazione la coda viene accuratamente asciugata.

Il tempo di reazione viene determinato prima e periodicamente dopo la somministrazione orale o sottocutanea della sostanza in esame, ad esempio dopo 0, 5, 1, 2, 3, 4 e 6 ore. Il tempo di interruzione dell'immersione è 15 s. Il tempo di attesa degli animali non trattati è compreso tra 1 e 5, 5 s. Pertanto, un tempo di sospensione superiore a 6 s è considerato come una risposta positiva.

Metodo della clip di coda di Heffner:

Una clip di arteria viene applicata alla radice della coda dei topi e si nota il tempo di reazione. Vengono utilizzati topi maschi (ceppo Charles River o altri ceppi) con un peso tra 18 e 25 g. Il gruppo di controllo è composto da 10 topi. I composti in esame vengono somministrati per via sottocutanea ai topi nutriti o per via orale agli animali a digiuno. I gruppi di test e il gruppo di controllo sono costituiti da 7-10 topi.

Il farmaco viene somministrato 15, 30 o 60 minuti prima del test. Una clip di arteria viene applicata alla radice della coda (circa 1 cm dal corpo) per indurre dolore. L'animale risponde rapidamente a questo stimolo nocivo mordendo la clip o la coda vicino alla posizione della clip. Il tempo tra l'inizio della stimolazione e la risposta è misurato da un cronometro in incrementi di 1/10 di secondo.

Attività antiulcera :

Legatura del piloro nei ratti (Shay Rat):

Ratti femmine Wister che pesano 150-170 g sono affamati per 48 ore avendo accesso all'acqua potabile ad libitum. Durante questo periodo vengono alloggiati in gabbie singole con il fondo rialzato di una larga rete metallica per evitare cannibalismo e coprofagia. Dieci animali sono usati per dose e come controlli. Sotto l'anestesia dell'etere viene praticata un'incisione addominale sulla linea mediana. Il piloro è legiferato, si sta facendo attenzione a non danneggiare il sangue.

Non si verifica alcuna alimentazione o trazione sul piloro. Afferrare lo stomaco con gli strumenti deve essere evitato meticolosamente; altrimenti l'ulcerazione si svilupperà invariabilmente in tali punti. La parete addominale è chiusa da punti di sutura. I composti del test vengono somministrati per via orale mediante sonda gastrica o iniettati per via sottocutanea.

Gli animali sono posizionati per 19 ore in cilindri di plastica con un diametro interno di 45 mm chiuso su entrambe le estremità da una rete metallica. Successivamente, gli animali vengono sacrificati in anestesia CO ₂ . L'addome è aperto e una legatura è posizionata intorno all'esofago vicino al diaframma.

Lo stomaco viene rimosso e il contenuto viene drenato in una provetta da centrifuga. Lungo la maggiore curvatura lo stomaco viene aperto e bloccato su un piatto di sughero. La mucosa viene esaminata con uno stereo microscopio. Nel ratto, i due quinti superiori dello stomaco formano il rumine con epitelio squamoso e possiedono piccoli meccanismi protettivi contro l'azione corrosiva del succo gastrico.

Al di sotto di una cresta limitante, nella porzione ghiandolare dello stomaco, i meccanismi protettivi sono migliori nella mucosa del medio due quinti dello stomaco rispetto alla parte più bassa, formando l'antro.

Pertanto, le lesioni si verificano principalmente nel rumine e nell'antro. Il numero di ulcere è annotato e la severità registrata con i seguenti punteggi:

. 0 = nessuna ulcera

. 1 = ulcere superficiali

. 2 = ulcere profonde

. 3 = perforazione.

Il volume del contenuto gastrico è misurato. Dopo la centrifugazione, l'acidità viene determinata mediante titolazione con 0, 1 n di NaOH.

Valutazione:

Viene calcolata una UI dell'indice di ulcera:

UI = UN + US + UP x 10-1

io. UN = media del numero di ulcere per animale

ii. US = media del punteggio di gravità

iii. UP = percentuale di animali con ulcere

L'indice dell'ulcera e l'acidità del contenuto gastrico degli animali trattati sono confrontati con i controlli. Usando varie dosi, possono essere stabilite curve dose-risposta per la formazione dell'ulcera e la secrezione acida gastrica. I valori ID50 possono essere calcolati mediante analisi di probità, per cui lo 0% corrisponde a zero e il 100% alla massima produzione di acido gastrico stimolata.

Stress ulcera attraverso lo stress di immobilizzazione:

Vengono utilizzati gruppi di 10 ratti Wister femmine per dose di farmaco in esame e per controlli di peso 150-170 g. Cibo e acqua vengono ritirati 24 ore prima dell'esperimento. Dopo somministrazione orale o sottocutanea del composto in esame o della soluzione placebo, gli animali sono leggermente anestetizzati con etere.

Entrambe le estremità inferiore e superiore sono fissate insieme e gli animali sono avvolti in uno sguardo fisso. Sono sospese orizzontalmente al buio a 20 ° C per 24 ore e infine sacrificate in anestesia CO ₂ . Lo stomaco viene rimosso, fissato su una piastra di sughero e il numero e la gravità delle ulcere viene registrato con uno stereomicroscopio usando i seguenti punteggi:

.0 = nessuna ulcera

.1 = ulcere superficiali

.2 = ulcere profonde.

.3 = perforazione

Valutazione

Viene calcolata una UI dell'indice di ulcera:

UI = UN + US + UP x 10-1

ONU - media del numero di ulcere per animale.

US = media del punteggio di gravità.

SU - percentuale di animali con ulcere