HLA: metodi di test di istocompatibilità

Metodi di test di istocompatibilità!

Il sistema HLA è ampiamente polimorfico. La natura polimorfica degli alleli HLA fu inizialmente trovata e definita con metodi sierologici e gli antigeni HLA ricevettero numeri. Successivamente è stato trovato che gli antigeni con la stessa specificità sierologica possono avere sequenze di ammino acidi differenti. Nel 1999, il numero di alleli HLA noti superava 1000, e il numero è ancora in aumento. A causa dell'ampio polimorfismo, la nomenclatura degli alleli HLA è complessa ed è anche difficile per una persona comprendere la nomenclatura, a meno che la persona non si trovi nel campo dell'istocompatibilità.

Ai primi alleli sequenziati venivano assegnati nomi con due cifre che corrispondevano alla loro specificità sierologica. Le prime due cifre sono seguite da altre due cifre che indicano l'ordine cronologico di denominazione da parte del comitato di nomenclatura dell'OMS per i fattori del sistema HLA. (Ad esempio: il primo allele sequenziato da un gene HLA-A2 è stato chiamato HLA-A 0201 e il secondo allele sequenziato è stato denominato HLA-A 0202.)

La tipizzazione HLA viene effettuata mediante metodi di tipizzazione sierologici o metodi di tipizzazione molecolare. I metodi di tipizzazione HLA sierologici rilevano gli epitopi delle molecole HLA, mentre i metodi molecolari rilevano le sequenze nucleotidiche.

io. La tipizzazione HLA che definisce i gruppi di alleli (di solito approssimando le specificità sierologiche) viene definita come digitazione a bassa risoluzione o generica (ad esempio, HLA-DRBl-04).

ii. La digitazione che risolve tutti gli alleli noti viene definita tipizzazione HLA ad alta risoluzione (ad esempio, HLA-DR BI x401).

iii. La digitazione che si risolve oltre le specificità sierologiche, ma che non raggiunge il livello allelico, viene definita tipizzazione a risoluzione intermedia (ad esempio, HLA-DRBl-0401/09/13/16/21/26/33).

Il National Marrow Donor Program ha creato il codice per facilitare la gestione di questi complessi dati a risoluzione intermedia. In questo sistema, il nome per HLA-BRBl-0401/09/13/16/21/26/23 / è DRBl-04EJV.

Test di istocompatibilità con metodi sierologici:

I linfociti vengono utilizzati per la tipizzazione HLA sierologica, lo screening degli anticorpi e la corrispondenza incrociata.

Isolamento dei linfociti per la tipizzazione HLA:

io. Il sangue venoso periferico viene miscelato con Ficoll-Hypaque e centrifugato. Lo strato contenente cellule mononucleate del sangue periferico viene aspirato, lavato e usato.

ii. Vengono utilizzati linfociti isolati dai linfonodi e dalla milza di cadaveri.

iii. La tipizzazione HLA per antigeni di classe II viene effettuata con popolazioni di cellule B arricchite (approssimativamente l'80% delle cellule T normali del sangue periferico sono cellule T di riposo che non hanno antigeni di classe II sulla loro superficie).

iv. Per isolare le cellule T vengono utilizzate perline magnetiche rivestite di mAb anti-CD2 o anti-CD3; e le sfere magnetiche rivestite con mAb anti-CD19 sono usate per isolare le cellule B.

Rilevazione di antigeni HLA di linfociti:

Il test di micro citotossicità è un test di linfototossicità dipendente dal complemento. Sono commercialmente disponibili vassoi di tipizzazione surgelati contenenti pozzetti rivestiti con diversi anticorpi contro antigeni HLA.

Circa 2000 linfociti vengono dispensati in ciascun pozzetto del vassoio e incubati per 30 minuti a temperatura ambiente. (Gli anticorpi in ciascun pozzetto si legano a specifici antigeni HLA sulla superficie dei linfociti, se presenti.)

↓

Cinque μl di complemento (di solito, siero di coniglio) viene aggiunto a ciascun pozzetto e incubato per 60 minuti (le proteine ​​del complemento causano la morte dei linfociti ricoperti di mAbs. In assenza di legame dei mAb con i linfociti, il complemento non viene attivato e i linfociti non sono uccisi).

↓

Si aggiunge la tintura di eosina Y, seguita dalla formaldeide (la formaldeide corregge la reazione).

↓

Quindi le cellule morte e le cellule vive in ciascun pozzetto sono contate con un microscopio a contrasto di fase.

io. Le cellule gonfiose e scure sono cellule morte (la eosina Y colorante entra nelle cellule morte).

ii. Le cellule luminose e refrattarie sono cellule vive (la tintura di eosina Y non entra nelle cellule vive).

Ogni pozzetto nel vassoio è visto individualmente per le cellule morte e le cellule vive. La percentuale di celle morte in ciascun pozzetto viene calcolata e il punteggio viene eseguito secondo la Tabella 27.5.

Tabella 27.5: punteggio del test di linotossicità per l'HLA:

Il tipo di HLA di un individuo è determinato dall'interpretazione della reazione dei linfociti dell'individuo con diversi antisieri utilizzati nel test di linfototossicità dipendente dal complemento.

io. Ci si aspetta che ogni individuo abbia due antigeni HLA-A, due HLA-B e due HLA-C sulla superficie dei linfociti.

ii. Se un individuo mostra solo un antigene HLA-A o HLA-B o HLA-C nel test, probabilmente quell'individuo è omozigote per quel particolare antigene o il pannello di antisieri usato nel test non ha l'anticorpo specifico contro il secondo antigene o c'è bassa espressione di molecole HLA sulla superficie dei linfociti.

Il dosaggio della linfototossicità dipendente dal complemento per antigeni HLA-DR e HLA-DQ viene effettuato utilizzando cellule B isolate da magne perline magnetiche rivestite da mAB o cellule B isolate su lana di nylon.

La maggior parte dei sieri di tipizzazione HLA sono ottenuti da donne multiparo. Poiché le donne mutioparose sono ripetutamente esposte agli antigeni HLA dei feti, i sieri delle donne multiparamiche hanno anticorpi contro gli antigeni HLA. Quasi 200 diversi antisieri sono usati per digitare gli antigeni HLA di un individuo.

Inizialmente si pensava che si potessero sviluppare mAbs per ciascuno degli antigeni HLA e la tipizzazione HLA sarebbe stata semplice. Ma molti mAbs si legano agli epitopi comuni piuttosto che agli epitopi privati ​​degli antigeni HLA. Inoltre, molti mAbs murini non risolvono il complemento (e quindi il loro uso nei test del complemento-linfotossicità è limitato).

Tuttavia, i mAbs murini possono essere utilizzati nel metodo ELISA e nel metodo di citometria a flusso, che non richiedono complemento. Ultimamente, molti laboratori preferiscono utilizzare la tipizzazione HLA molecolare piuttosto che la tipizzazione HLA sierologica.

Screening del siero del ricevente del trapianto per gli anticorpi contro gli antigeni di IL-ILA (screening degli anticorpi):

La presenza di anticorpi contro gli antigeni HLA nel siero di un paziente in attesa di trapianto di organi è di solito eseguita mediante linfototossicità complemento-dipendente. I linfociti con antigeni e complemento HLA noti vengono miscelati con il siero del ricevente. Dopo l'appropriata incubazione, vengono contati i linfociti morti e i linfociti vivi. Viene quindi calcolato l'anticorpo reattivo del pannello percentuale (PRA).

PRA = numero di celle positive / numero di celle panel totali x 100

Il PRA indica l'entità della sensibilizzazione del paziente in attesa agli antigeni HLA.

Metodo ELISA per lo screening degli anticorpi HLA sierici:

Il metodo ELISA è facile, veloce e non richiede linfociti vivi e complemento. Gli antigeni HLA purificati per affinità sono rivestiti sulle pareti della piastra di microtitolazione

↓

Il siero del ricevente viene aggiunto e incubato

↓

Dopo il lavaggio, vengono aggiunte e incubate IgG umane anti-umane coniugate.

↓

Dopo il lavaggio, il substrato viene aggiunto e incubato.

io. Lo sviluppo del colore in un particolare pozzetto indica la presenza di anticorpi IgG contro l'antigene HLA rivestito su quel particolare pozzetto.

ii. Il mancato sviluppo del colore in un particolare pozzetto indica l'assenza di anticorpi contro il particolare antigene HLA rivestito su quel pozzetto.

Citometro a flusso per rilevare gli anticorpi HLA del siero:

Le microsfere rivestite con antigeni HLA sono incubate con il siero del paziente e quindi con anticorpi anti-IgG umani marcati con fluorescenza. La percentuale di perline che macchia sopra lo sfondo fornisce la misura degli anticorpi reattivi del pannello percentuale del paziente (PRA).

Cross Matching:

Se il sangue di un ricevente in attesa contiene anticorpi contro gli antigeni HLA del donatore, gli antigeni HLA sulle cellule del donatore saranno attaccati dagli anticorpi del ricevente, dopo il trapianto. Pertanto, prima del trapianto, è essenziale sapere se il ricevente ha anticorpi contro gli antigeni HLA del donatore.

Se nel siero del ricevente sono presenti anticorpi specifici dell'antigene HLA donatore, il trapianto verrà rifiutato. La corrispondenza incrociata viene effettuata per rilevare la presenza di anticorpi sierici del ricevente in attesa contro gli antigeni HLA donatori proposti.

Citotossicità della linfa Corrispondenza incrociata con linfociti del sangue periferico:

Linfociti del sangue periferico del donatore proposto (che contiene approssimativamente l'80% di cellule T (che recano antigeni di classe I MHC) e il 20% di cellule B e monociti (che portano antigeni di classe I e II classe MHC) vengono miscelati con il siero del ricevente in attesa e incubati .

↓

Il complemento è aggiunto e incubato.

↓

La tintura di eosina Y viene aggiunta e incubata.

io. Viene contato il numero di cellule morte e vitali e viene calcolata la percentuale di cellule morte. Il 50 percento o più di morte cellulare indica un cross match fortemente positivo (cioè il siero del ricevente ha anticorpi in grado di reagire con antigeni HLA donatori). Una forte corrispondenza incrociata positiva tra un ricevente e un donatore proposto è una controindicazione per il trapianto di organi dal donatore al ricevente.

Per scoprire se gli anticorpi del ricevente sono diretti contro gli antigeni di classe I o di classe II, vengono eseguite rispettivamente la corrispondenza incrociata della linfototossicità delle cellule T (utilizzando cellule T arricchite) o la corrispondenza incrociata della linfototossicità delle cellule B (utilizzando cellule B arricchite).

La corrispondenza incrociata del citometro a flusso è 30-250 volte più sensibile rispetto ai metodi sierologici visivi per il rilevamento degli anticorpi IgG contro gli antigeni HLA sulla superficie dei linfociti.

I linfociti del sangue periferico del donatore proposto vengono incubati con anticorpi anti-CD3 etichettati (ad esempio un colorante fluorescente che emette luce verde), che si legano alle cellule T.

↓

Le cellule T legate ani-CD3 marcate sono separate dalle cellule B nel citometro a flusso.

↓

Le cellule T separate e colorate vengono ora incubate con il siero del destinatario in attesa.

io. Gli anticorpi sierici del ricevente contro gli antigeni HLA delle cellule T donatrici, se presenti, si legheranno alle cellule T.

↓

Dopo il lavaggio, viene aggiunto e incubato un flurocromo (che emette un anticorpo anti-umano marcato con il colore, diverso dal verde, ad esempio di colore rosso).

ii. Le IgG anti-umane marcate con florocromo si legheranno agli anticorpi HLA del ricevente, che sono legati alle cellule T del donatore.

Il citometro a flusso conta il numero di cellule T (colore rosso e verde) e le cellule T (colore verde) e crea un istogramma.

Corrispondenza incrociata per autoanticorpi contro linfociti:

Durante una partita incrociata, gli autoanticorpi contro i linfociti nel siero del ricevente possono legarsi in modo non specifico ai linfociti del donatore e fornire un risultato di cross-match falsamente positivo; e di conseguenza, il donatore viene squalificato per errore dall'organo donatore al particolare destinatario. Gli autoanticorpi possono anche mascherare la presenza di specifici anticorpi anti-donatore.

La presenza di autoanticorpi contro i linfociti viene rilevata dall'auto cross match, in cui i linfociti e il siero del ricevente sono combinati in un test di citotossicità standard. Le partite incrociate di Autoanticorpi vengono ordinariamente effettuate in concomitanza con tutte le partite incrociate dei donatori viventi per ciascun siero che viene testato.

Metodi di biologia molecolare per la tipizzazione HLA:

La maggior parte dei metodi di tipizzazione molecolare utilizza la tecnica della reazione a catena della polimerasi (PCR) per amplificare selettivamente i segmenti del gene HLA richiesti per la tipizzazione.

Tipizzazione del priming (SSP) per la sequenza specifica:

Il DNA dell'individuo viene estratto da cellule o tessuti

↓

Il DNA viene aggiunto a provette contenenti diversi set di primer per diversi geni HLA. Un set aggiuntivo di primer è incluso come controllo positivo dell'amplificazione in tutti i tubi.

`↓

Vengono aggiunti gli altri componenti della reazione di PCR (come nucleotidi di DNA, DNA polimerasi, tampone) e viene eseguito il ciclo termico.

↓

I prodotti amplificati sono elettroforesi in gel con bromuro di etidio e fotografati sotto luce UV.

io. La presenza della banda indica che il campione di DNA ha la sequenza corrispondente al particolare tipo di HLA.

ii. L'assenza di banda indica che il campione di DNA non contiene la particolare sequenza del tipo di HLA.

iii. La banda di controllo dell'amplificazione interna deve essere presente per l'interpretazione.

Set di primer per la tipizzazione HLA sono disponibili in commercio.

io. Per la tipizzazione HLA-A, B e C sono necessarie circa 100-200 reazioni.

ii. Per la tipizzazione HLA-DRB sono necessarie circa 20-30 reazioni.

Ibridazione della sonda oligonucleotidica (SSOP) specifica per sequenza:

Il metodo SSOP prevede l'amplificazione selettiva del target HLA seguita dall'ibridazione in un pannello di sonde oligonucleotidiche. Esistono due formati SSOP.

io. Macchia di punti o slot:

Il DNA amplificato è legato al supporto solido (come la membrana di nylon) e la sonda di ibridazione è in soluzione.

ii. Punto inverso o macchia slot:

La sonda è legata al supporto solido e ibridata al DNA amplificato in soluzione.