Metodi di saggio di immunoassorbimento enzimatico (ELISA) per la rilevazione di antigeni

Metodi di analisi immunoassorbente enzimatico (ELISA) per la rilevazione di antigeni!

Il metodo immnoassorbente legato all'enzima può essere utilizzato per rilevare l'antigene o l'anticorpo. Il metodo ELISA ha molti vantaggi rispetto ad altri metodi (Tabella 27.2).

Il metodo ELISA è sensibile da 10 a 1000 volte rispetto ai metodi più vecchi come l'agglutinazione e l'immunoelettroforesi. Sono disponibili varie modifiche di ELISA, alcune delle quali sono descritte qui.

Tabella 27.2: Vantaggi dei saggi immunologici enzimatici

1. L'effetto di amplificazione degli enzimi porta allo sviluppo di saggi più sensibili

2. I reagenti hanno una lunga durata e sono relativamente economici

3. È possibile sviluppare un'ampia varietà di configurazioni di dosaggio

4. L'attrezzatura è meno costosa e ampiamente disponibile

5. Nessun rischio di radiazioni

6. Può essere eseguito anche in piccoli laboratori

Anticorpi per saggio:

L'antigene noto è rivestito su un pozzetto di micropiastre (piccola placca di plastica, trattata per massimizzare il legame alle proteine, contiene 96 pozzetti con un volume di 200 μl).

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Il siero del test umano viene aggiunto al pozzetto e incubato.

io. Se il siero contiene anticorpi contro l'antigene rivestito, gli anticorpi si legano agli antigeni.

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I pozzetti vengono lavati per rimuovere i componenti del siero non legati.

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L'immunoglobulina anti-umana coniugata con enzima (nota come coniugato) viene aggiunta ai pozzetti e incubata.

ii. Il coniugato si lega agli anticorpi legati all'antigene nel pozzetto.

iii. Se il siero del test non contiene anticorpi contro l'antigene, il coniugato rimane nella soluzione.

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I pozzetti vengono lavati per rimuovere il coniugato non legato.

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Un substrato adatto viene aggiunto ai pozzetti e incubato.

iv. L'enzima del coniugato nel complesso antigene-anticorpo coniugato agisce sul substrato e divide il substrato per produrre un prodotto colorato. Lo sviluppo del colore indica che l'anticorpo specifico dell'antigene rivestito nei pozzetti è presente nel siero del test.

v. Il mancato sviluppo del colore indica che il siero del test non ha anticorpi contro l'antigene rivestito sui pozzetti.

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Una soluzione di arresto (di solito, acido solforico IN) viene aggiunta per arrestare la reazione. Quindi la piastra viene tenuta in un lettore ELISA e viene misurata la densità ottica (OD) dei pozzetti. L'OD corrisponde alla quantità di anticorpi nel siero del test.

Usando le concentrazioni note di anticorpi, si può costruire un grafico. Le concentrazioni anticorpali vengono tracciate sull'asse X e le corrispondenti OD vengono tracciate sull'asse Y e viene disegnata una curva. Interpolando il valore OD del siero del test, viene determinata la concentrazione di anticorpi in un siero del test.

Antigene da analizzare:

Un anticorpo monoclonale noto (indicato come anticorpo primario) ad un antigene è rivestito sui pozzetti della microtitolazione.

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Il campione che si suppone contenga l'antigene viene aggiunto al pozzetto e incubato.

io. Se il campione contiene l'antigene corrispondente, l'antigene si lega all'anticorpo sul pozzetto e forma un complesso antigene-anticorpo.

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I pozzetti vengono lavati per rimuovere i materiali non legati.

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Un mAb coniugato noto enzima (chiamato come coniugato) contro l'antigene viene aggiunto ai pozzetti e la piastra viene incubata.

io. Se il pozzetto contiene un complesso antigene-anticorpo, il coniugato si lega all'antigene nel complesso.

ii. Se non esiste un complesso antigene-anticorpo, il coniugato rimane in soluzione.

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I pozzetti vengono lavati per rimuovere il coniugato non legato. Un substrato adatto viene aggiunto e incubato.

io. Se c'è del coniugato nel pozzetto, l'enzima del coniugato divide il substrato e produce un prodotto colorato.

iii. L'assenza di sviluppo del colore indica che non vi è alcun antigene nel campione (contro l'anticorpo rivestito sui pozzetti).

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Viene aggiunta una soluzione di arresto per arrestare la reazione. Le OD dei singoli pozzetti vengono letti nel lettore ELISA. Come spiegato in precedenza, viene costruito un grafico (costituito da diverse concentrazioni di antigeni sull'asse X e le corrispondenti OD sull'asse Y) e viene disegnata la curva. La concentrazione dell'antigene nel campione di prova è determinata dall'interpolazione della sua OD.

Metodo ELISA per l'acquisizione di anticorpi:

I pozzetti della piastra per microtitolazione sono rivestiti con anticorpi IgM anti-umani.

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Il siero del paziente viene aggiunto e incubato. Gli anticorpi IgM nel siero si legano agli anticorpi IgM anti-umani sui pozzetti.

I pozzetti vengono lavati e quindi un antigene noto viene aggiunto e incubato.

io. Se nel pozzetto sono presenti anticorpi IgM anti-antigene, l'antigene si lega all'anticorpo IgM e rimane nel pozzetto.

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I pozzetti vengono lavati per rimuovere l'antigene non legato

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Un mAb coniugato con enzima all'antigene viene aggiunto e incubato.

io. Se l'antigene è presente nel pozzetto (complesso anti-IgM-IgM-antigene), il coniugato si legherà all'antigene.

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I pozzetti vengono lavati per rimuovere il coniugato non legato e viene aggiunto il substrato.

io. Lo sviluppo del colore indica che gli anticorpi IgM contro l'antigene sono presenti nel siero del paziente.

ii. Il mancato sviluppo del colore indica che il siero del paziente non contiene anticorpi IgM contro l'antigene.

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La soluzione di arresto viene aggiunta e le OD dei pozzetti vengono misurate singolarmente nel lettore ELISA. La quantità di anticorpi IgM contro l'antigene può essere determinata tracciando un grafico come descritto in precedenza.

Una procedura simile può essere adottata per rilevare gli anticorpi IgG contro un antigene.

Gli enzimi comunemente usati nelle tecniche ELISA sono la perossidasi di rafano e la fosfatasi alcalina (Tabella 27.3). Questi enzimi sono accoppiati covalentemente agli mAbs. Una varietà di substrati sono agiti da questi enzimi per produrre prodotti colorati. Poiché l'ultimo passaggio del metodo ELISA è enzimatico, il metodo ELISA è estremamente sensibile (cioè sono rilevabili concentrazioni molto basse di antigene o anticorpo).

La sensibilità dei saggi ELISA è migliorata utilizzando reagenti aggiuntivi (ad esempio, biotina / dosaggio avidinimmunologico). Recentemente, l'uso di substrati di perossidasi di rafano che producono prodotti chemiluminescenti ha ulteriormente migliorato la sensibilità. La misurazione della velocità della reazione, piuttosto che l'entità della reazione in un singolo istante fisso, fornisce risultati ELISA quantitativi più accurati.

Tabella 27.3: Caratteristiche degli enzimi utilizzati nei saggi immunoenzimatici:

ELISA potenziato con Biotina-Avidina:

Invece di etichettare il mAb con un enzima, il MAb può essere etichettato con biotina (Vitamina B ₁₂ ).

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Quindi si aggiunge l'avidina marcata con l'enzima (una componente proteica dell'albume).

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L'avidina si lega alla biotina con sensibilità e affinità molto elevate. Successivamente viene aggiunto il substrato. L'enzima (nel complesso mAb-biotina-avidina-enzima) agisce sul substrato e produce un prodotto colorato.

Il potenziamento della biotina-avidina è anche usato nei saggi Immuno-fluorescenti.

Immunoanalisi enzimatico su microparticelle:

Invece di rivestire i pozzetti con micropiastra con antigeni o anticorpi, le microsfere (1 mm di diametro) sono rivestite con antigene o anticorpo e vengono eseguiti saggi ELISA. Le microparticelle offrono un'area di superficie più ampia per il rivestimento di antigeni o anticorpi in modo da poter rivestire più alte concentrazioni di antigene o anticorpo, il che aiuta a ridurre il tempo necessario per le reazioni leganti.

Il dosaggio immunoenzimatico fluorescente è identico agli altri EIA, tranne per il fatto che utilizzano substrati fluorescenti. Nell'EIA fluorescente, il fluoroforo è generato da una reazione enzimatica. Dopo l'eccitazione del fluoroforo alla sua lunghezza d'onda ottimale, viene emessa luce a una lunghezza d'onda caratteristica. Viene misurata la luce fluorescente emessa.

Fluoroimmunoassay risolto nel tempo:

Questo metodo richiede una strumentazione speciale e speciali etichette fluorescenti per aumentare la sensibilità del test. L'etichetta fluorescente usata in questo saggio mostra una fluorescenza ritardata con un periodo di tempo di 100 ns o più tra eccitazione ed emissione. La maggior parte delle sostanze responsabili della fluorescenza di fondo hanno un breve periodo di decadimento. Pertanto, la misurazione del segnale di fluorescenza ritardata ridurrà gli effetti della fluorescenza di fondo.

Questo scopo è raggiunto con l'uso di un fluorometro speciale a risoluzione temporale che produce un impulso di luce veloce che eccita il fluoroforo. La fluorescenza viene misurata poco dopo l'eccitazione. Pertanto, l'effetto di uno sfondo non specifico, che generalmente decade in meno di 10 ns, può essere eliminato.

I fluorofori che presentano una fluorescenza ritardata sono:

io. Derivati ​​del pirene con un tempo di decadimento di quasi 100 ns.

ii. Etichette chelate di metalli di terre rare [come europio (Eu ³⁺ ), samario (Sm ³⁺ ) e terbio (Tb ³⁺ )] che hanno un tempo di decadimento molto lungo di circa 50-100 μs.

Immunodosaggio chemiluminescente:

I saggi immunologici chemiluminescenti (CL-EIA) utilizzano substrati chemiluminescenti che reagiscono con vari enzimi. La reazione di substrato-enzima chemiluminescente genera luce, simile alla bioluminescenza. I sistemi EIA chemiluminescenti sono un netto miglioramento rispetto a RIA in termini di sensibilità, efficienza temporale e semplicità procedurale.

I saggi immunologici a chemiluminescenza utilizzano come etichette le molecole che generano chemiluminescenza.

io. Derivati ​​luminol

ii. Esteri di acridinio

iii. Derivati ​​nitrofenil ossalati

iv. Rutenio tri-bipridile con tripropilamina per elettrochemiluminescenza

v. Fondamentalmente, i metodi di analisi non differiscono da RIA / FIA.