Saggi di complemento di antigeni e anticorpi

Saggi di complemento di antigeni e anticorpi!

Sono disponibili metodi per la determinazione accurata di ciascuna delle componenti del complemento di tutte e tre le vie di attivazione del complemento e diversi enzimi e regolatori del sistema del complemento.

Tuttavia, molti dei test sono disponibili solo nei laboratori di ricerca.

Esistono due tipi di analisi del complemento:

1. Saggi che misurano le proteine ​​del complemento come antigeni.

2. Saggi che misurano l'attività funzionale del complemento.

Le analisi che misurano le proteine ​​del complemento come antigeni sono generalmente semplici da eseguire, a buon mercato, richiedono meno tempo e possono essere eseguite in molti laboratori. Ma questi saggi antigenici non forniscono informazioni sulle capacità funzionali dei componenti del complemento perché questi saggi di antigene del complemento rilevano sia componenti del complemento funzionalmente attivo che i prodotti di degradazione del complemento.

io. Generalmente, i test antigenici non sono così sensibili come i saggi funzionali.

ii. I saggi antigenici non rilevano bassi livelli di componenti del complemento in alcuni fluidi corporei.

iii. Sono disponibili saggi ELISA per la misurazione di prodotti suddivisi di componenti o complessi del complemento che si formano durante l'attivazione del complemento.

iv. L'attivazione del complemento attraverso il percorso classico può essere misurata seguendo i livelli di C4d e C4 nel siero.

v. La misurazione ELISA dei complessi C1r-C1s-C1INH fornisce una misura dell'attivazione del complemento tramite la via classica.

VI. L'attivazione di un percorso alternativo può essere misurata con il metodo ELISA valutando i livelli di complessi Bb o C3bBbP in circolazione.

vii. L'attivazione di un percorso classico o alternativo può essere monitorata misurando i livelli di iC3b o la forma solubile del complesso di attacco di membrana sC5b6789.

viii. Sono disponibili kit ELISA per misurare l'anafilotaxina C3a e C5a in siero o plasma.

Gestione dei campioni per analisi del complemento:

La corretta gestione dei campioni è fondamentale per i saggi funzionali del complemento. Alcuni componenti del complemento sono altamente labili.

io. Per la maggior parte dei saggi funzionali, il siero, piuttosto che il plasma, è preferito perché i chelanti del calcio (come l'EDTA, l'eparina) utilizzati per ottenere il plasma possono essere anti-complementari.

ii. Per i test funzionali, il sangue dovrebbe coagularsi a temperatura ambiente per 30-60 minuti e poi su ghiaccio per almeno un'ora.

iii. Per i saggi di legame Clq, il sangue deve coagulare per 2 ore a temperatura ambiente. Il coagulo viene cerchiato e centrifugato a 0 ° C a 4 ° C per cinque minuti. Se si sospetta la presenza di anticorpi crioprecipitanti, la formazione di coaguli e la centrifugazione del sangue devono essere effettuati a 37 ° C poiché la fissazione del complemento può verificarsi se il campione è raffreddato.

iv. I campioni di siero o plasma devono essere divisi in aliquote in più piccoli volumi e conservati immediatamente tra 40 e -80 ° C.

v. Quando i sieri vengono trasferiti, devono essere ben sigillati e posti in contenitori con grandi quantità di ghiaccio secco.

Complementi funzionali:

I tamponi utilizzati nei saggi funzionali del complemento sono fondamentali perché le variazioni di molarità e le concentrazioni di ioni metallici possono influenzare i valori del titolo del complemento. Saggio CH ₅₀ per via classica del complemento: il dosaggio funzionale più semplice del percorso classico misura il complemento emolitico totale.

L'assenza di uno qualsiasi dei componenti del complemento produce un titolo emolitico totale del complemento (CH ₅₀ ) pari a zero. Gli eritrociti di pecora sono generalmente usati come cellule bersaglio per misurare il CH ₅₀ o l'attività funzionale di componenti del complemento isolato. I globuli rossi delle pecore sono più sensibili agli anticorpi e alla lisi mediata dal complemento rispetto ai globuli rossi di altre specie.

Analisi AH ₅₀ per la via del complemento alternativo:

Gli eritrociti di coniglio sono usati per misurare AH ₅₀ . I globuli rossi del coniglio sono sensibili alla lisi indipendente dagli anticorpi mediata dal siero umano.

io. I saggi CH ₅₀ e AH ₅₀ sono saggi di screening eccellenti per escludere la deficienza genetica dei componenti del complemento.

ii. L'attività normale di CH ₅₀ con valori di AH ₅₀ ridotti deriva da difetti nella via del complemento alternativo.

iii. Le carenze nei componenti del complemento del terminale comportano la perdita di entrambe le attività CH ₅₀ e AH ₅₀ .

iv. La mancanza omozigote di un componente del complemento annulla totalmente il dosaggio emolitico.

Il grado di emolisi è influenzato da molti fattori, come la concentrazione di eritrociti, la fragilità (età) degli eritrociti, la quantità di anticorpi utilizzati per la sensibilizzazione, la natura dell'anticorpo (IgG o IgM), la forza ionica del sistema tampone, P ^H, tempo di reazione, temperatura e concentrazioni di calcio ²⁺ o magnesio ²⁺ . Il valore per le unità CH50 nel siero umano è calcolato in diversi modi, come l'equazione di Von Krough.

Misurazione del deficit funzionale dei componenti del complemento individuale:

Quando la storia e i sintomi di un paziente suggeriscono un possibile deficit del componente del complemento, possono essere necessarie titolazioni emolitiche di singoli componenti. Per produrre lisi di eritrociti sono necessarie la presenza e l'attivazione di tutti i componenti del complemento (C1 - C9). Se un componente è assente, non si verifica emolisi. Sono necessari preparati puri di ciascuno dei componenti del complemento individuale per rilevare l'assenza di un particolare componente del complemento nel siero o nel plasma di un paziente.

Per misurare i singoli componenti del complemento, sono necessari componenti parzialmente purificati. Tuttavia, la misurazione di C4 è un'eccezione, a causa della disponibilità di siero di cavia C4-carenti (C4D). I sieri di umani con carenza di C2 e cavie e conigli con carenza di C6 sono disponibili in pochi laboratori.

Le analisi del complemento funzionale dei singoli componenti sono sensibili e forniscono informazioni accurate sull'attività di un componente del complemento. Ma la maggior parte di questi test sono limitati ai laboratori di ricerca.

Misurazione del componente del complemento individuale mediante analisi antigene:

La singola immunodiffusione radiale è il metodo più comune per quantificare componenti del complemento, come C3, C4 e il fattore B. Va ricordato che tutti i saggi funzionali del complemento possono essere inibiti dall'azione anti-complementare del siero (che può derivare da antigene complessi di anticorpi, eparina, agenti chelanti e immunoglobuline aggregate).

Test di correzione del complemento:

Quando c'è interazione antigene-anticorpo, i componenti del complemento vengono attivati ​​e consumati. Quindi il consumo in vitro del complemento indica la presenza di interazione antigene-anticorpo. Questo principio viene utilizzato per rilevare e misurare l'antigene o gli anticorpi nel test di fissazione del complemento.

Il test è fatto in due fasi. Nel primo stadio si verifica l'interazione antigene-anticorpo e il complemento viene consumato. Nel secondo stadio, viene utilizzato un sistema di indicatori per rilevare se il complemento è consumato o no nella reazione del primo stadio.

io. Se il complemento viene consumato nel primo stadio, significa che la reazione antigene-anticorpo si è verificata nel primo stadio.

ii. Se il complemento non viene consumato, significa che non c'è stata interazione antigene-anticorpo nel primo stadio.

Rilevazione di anticorpi mediante test di correzione del complemento:

Primo stadio:

Vengono prese le concentrazioni fisse di antigene noto e complemento (solitamente siero di cavia fresco usato come fonte di complemento). Il siero contenente (anticorpi sconosciuti) viene aggiunto e incubato.

A. Antigene noto + complemento + siero (corrispondenti anticorpi presenti). Il complemento viene consumato durante l'incubazione.

B. Antigene noto + complemento -1-siero (corrispondenti anticorpi assenti). Il complemento non viene consumato poiché il siero non contiene anticorpi specifici per l'antigene conosciuto.

Seconda fase:

Gli eritrociti di pecora rivestiti con anticorpi anti-eritrociti di coniglio vengono aggiunti ai tubi. In presenza di complemento, gli eritrociti di pecora saranno lisati (emolisi). In assenza di un complemento, gli eritrociti non si lisano (nessun emolisi).

A. Poiché il complemento è usato durante la reazione del primo stadio, gli eritrociti di pecora rivestiti con anticorpi non vengono lisati. Pertanto l'assenza di emolisi suggerisce che il siero contenga anticorpi specifici contro l'antigene utilizzato nel test.

B. Poiché il complemento non è utilizzato nel primo stadio, gli eritrociti di pecora rivestiti con anticorpi vengono emolizzati dal complemento nel secondo stadio. Pertanto, la presenza di emolisi suggerisce che il siero non contenga anticorpi specifici contro l'antigene utilizzato.

I test di fissazione del complemento sono ampiamente utilizzati nei laboratori clinici e nella ricerca. Virus, anticorpi sierici contro le infezioni virali, anticorpi contro Treponema pallidum che causano sifilide, anticorpi anti-fungini (Coccidioidomicosi immitis, Histoplasma capsulatum), anticorpi anti-Mycoplasma pneumoniae e anticorpi anti-riciclo sono rilevati mediante test di fissazione del complemento.