Note utili sui saggi di attivazione dei linfociti
Le capacità funzionali dei linfociti in risposta agli antigeni o ai mitogeni sono determinate dai test di attivazione dei linfociti.
Quindi, i test di attivazione dei linfociti sono più appropriati per valutare l'immunocompetenza dell'individuo rispetto ad una semplice enumerazione di linfociti.
Esistono due tipi di test di attivazione dei linfociti:
io. Rilevazione di "marker di attivazione" sulla superficie dei linfociti.
ii. Valutazione della capacità dei linfociti di proliferare dopo la stimolazione delle cellule T.
Gli stimoli delle cellule T più comunemente usati per valutare la proliferazione dei linfociti T sono:
io. Lectine [come fitoemagglutinina (PHA) e concanavalina A (ConA)
ii. Tossine batteriche che fungono da super antigeni
iii. Composti chimici [come miristato acetato di phorbal (PMA), ionofori di calcio
iv. Le citochine
v. mAbs ai recettori superficiali (in particolare le molecole CD3 sulle cellule T)
L'attivazione delle cellule B è indotta da:
io. Pokéus mitogeno (PWM). PWM attiva anche le cellule T
ii. Antigeni super
iii. lipopolisaccaridi
iv. mAbs che collegano le slg sulla superficie delle cellule B.
un. I linfociti purificati vengono coltivati in pozzetti da 96 pozzetti e stimolati con antigene o mitogeno (di solito per 48 ore).
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La timidina triziata ( 3 H-Tdr) viene aggiunta ai pozzetti e incubata
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Il contenuto dei pozzetti viene aspirato e filtrato sui filtri e viene misurata la quantità di 3 H Tdr nella carta filtro. L'incorporazione di 3 H-Tdr nel DNA cromosomico riflette la proliferazione cellulare.
b. Esistono dosaggi non radioattivi per determinare la proliferazione delle cellule. Questi test utilizzano coloranti fluorescenti che incorporano in DNA o coloranti che misurano la respirazione ossidativa come la MTT.
c. La bromodeoxyuridina (BrdU) è incorporata nel DNA di cellule altamente replicanti e quindi può essere utilizzata per valutare la proliferazione cellulare. Il BrdU incorporato nelle cellule viene rilevato utilizzando mAbs contro BrdU e citometria a flusso (come la rilevazione di antigeni intracellulari mediante citometria a flusso).
BrdU può anche essere somministrato a pazienti oncologici in vivo e successivamente il tumore può essere asportato e le cellule tumorali possono essere valutate per l'incorporazione di BrdU. Questo test fornisce un'idea sulla frazione proliferativa delle cellule tumorali in un paziente.
d. L'attivazione delle cellule T citotossiche viene saggiata mediante il dosaggio di 51 cromo:
Le cellule bersaglio sono etichettate con cromo radioattivo ( 51 Cr), che si lega alle proteine intracellulari delle cellule bersaglio.
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Le cellule bersaglio marcate sono incubate con cellule T citotossiche.
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La lisi delle cellule bersaglio da parte delle cellule T citolitiche determina il rilascio del 51 Cr.
Le cellule vengono centrifugate e viene misurato il rilascio di 51 Cr nel surnatante. La quantità di 51 Cr rilasciata è proporzionale alla lisi delle cellule.
