3 Classificazioni delle tecniche di agglutinazione
Tre tipi in cui sono classificate le tecniche di agglutinazione delle cellule sono: 1. agglutinazione diretta, 2. agglutinazione indiretta (passiva) e 3. agglutinazione inversa (passiva).
1. Test diretto di agglutinazione:
Le cellule (come batteri, funghi ed eritrociti) e gli antigeni particellari insolubili possono essere agglutinate direttamente dai loro anticorpi specifici. L'anticorpo ha due braccia Fab con le quali può legarsi agli antigeni su due cellule. Allo stesso modo molte molecole di anticorpi si legano con un numero di cellule per formare un reticolo.
Questa formazione del reticolo è vista visivamente come ciuffi. Quindi, la formazione di clumps indica la presenza di legame antigene-anticorpo. La mancanza di agglutinazione indica l'assenza di reazione antigene-anticorpo.
Usi del test diretto di agglutinazione:
un. Identificazione dei microbi:
Le colonie batteriche coltivate nei terreni di coltura sono identificate utilizzando antisieri noti contro i microbi. L'antisiero antimicrobico che produce una visibile agglutinazione identifica i batteri.
b. Diagnosi di infezioni microbiche rilevando la presenza di anticorpi contro i microbi nel siero. Gli antigeni microbici noti vengono miscelati con il siero del paziente e l'insorgenza di agglutinazione indica la presenza di anticorpi sierici contro il microbo.
c. Raggruppamento di sangue di ABO di erythrocytes umano (usando antisieri).
I test di agglutinazione vengono eseguiti sia sul vetrino (test di agglutinazione su vetrino) o in provetta (test di agglutinazione su provetta).
io. Il test di agglutinazione su vetrino è semplice e facile da eseguire e richiede solo pochi minuti per eseguire il test.
ii. Il test di agglutinazione su provette viene utilizzato per quantificare la quantità di anticorpi sierici contro un microbo diluendo serialmente il siero e quindi miscelando i sieri diluiti con una quantità costante di antigeni microbici. Dopo un'adeguata incubazione, la massima diluizione del siero che mostra l'agglutinazione visibile viene presa come titolo del siero (ad esempio, test della provetta Widal, test della provetta Brucella). Il titolo riflette la concentrazione di anticorpi nel siero; più alto è il titolo, più è la concentrazione di anticorpi.
I test su vetrino per la rilevazione di anticorpi sierici contro agenti infettivi vengono utilizzati come test iniziali di screening. I sieri dei test positivi sulla diapositiva devono essere testati nuovamente mediante test della provetta per confermare i risultati del test della diapositiva. Il test della diapositiva può dare risultati fuorvianti, specialmente con livelli di anticorpi sierici molto elevati (ad es., Il fenomeno prozona con gli anticorpi della brucella).
C'è molta variabilità intrinseca nei sistemi di test di agglutinazione. Quindi, quando i valori del titolo di siero di un paziente vengono controllati in due occasioni, la differenza tra i valori della titolazione è significativa, solo quando i valori del titolo differiscono di almeno due doppie diluizioni [o la differenza di due tubi (quattro volte il primo valore) ] (ad esempio nel test del tubo Widal, il siero viene diluito in due pieghe: 1 su 20, 1 su 40, 1 su 80, 1 su 160, 1 su 320 e 1 su 640. Se un paziente ha un primo test di Widal titolo di 1 su 160, il secondo titolo di test Widal è significativo se è 1 su 640 o più di 1 su 640.)
Test degli anticorpi eterofili:
(Spesso indicato come test mono-spot) Il test degli anticorpi eterofili è un test di emoagglutinazione per la rilevazione di anticorpi contro il virus Epstein Barr (EB) che causa la malattia della mononucleosi infettiva. Gli anticorpi IgM formati durante la mononucleosi infettiva si incrociano con gli antigeni di superficie dei RBC equini (probabilmente a causa della somiglianza antigenica tra il virus EB e le proteine di superficie dell'RC equino) e causano l'emolutinazione.
Test di agglutinazione indiretta (passiva):
Nel test di agglutinazione indiretta, gli antigeni solubili noti vengono rivestiti su altre cellule (ad es. Eritrociti di pecora o di tacchino) o particelle inerti (ad esempio lattice, bentonite, carbone di legna, polistirene) che fungono da portatori passivi di antigeni.
Molti antigeni possono essere rivestiti sugli eritrociti direttamente o dopo aver trattato gli eritrociti con formalina, acido tannico o glutaraldelyde. I vantaggi dell'utilizzo di eritrociti per il rivestimento sono la loro facile disponibilità e capacità di stoccaggio. Inoltre questi test sono altamente sensibili.
Il siero del test viene miscelato con eritrociti o lattice noti con rivestimento antigene.
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Se il siero del test ha anticorpi, gli eritrociti o le particelle di lattice agglutinano e producono ammassi visibili.
Saggio di emoagglutinazione:
I test di emagglutinazione sono semplici e facili da eseguire. Entrambi i test qualitativi e quantitativi possono essere eseguiti con la tecnica di emoagglutinazione.
Il siero da testare viene diluito in serie in una soluzione diluente in pozzetti di micropiastre.
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I globuli rossi rivestiti con un antigene noto vengono aggiunti in volumi uguali a tutti i pozzetti. Vengono utilizzati controlli positivi, controlli negativi e reagenti appropriati. La piastra viene agitata bene e incubata in un luogo privo di vibrazioni.
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Dopo l'incubazione, la piastra viene letta con gli occhi nudi per l'agglutinazione.
Reazione positiva:
I pozzetti con agglutinazione indicano il legame dei globuli rossi con rivestimento antigene con corrispondenti anticorpi nel siero del test. Il fondo del pozzo agglutinato è descritto per avere un aspetto tappeto.
Reazione negativa:
Nei pozzi in cui non vi è alcun legame antigene-anticorpo, non si verifica agglutinazione di globuli rossi. A causa della gravitazione, i globuli rossi si depositano sul fondo dei pozzetti e danno un aspetto simile a un "bottone", in cui il bordo del "pulsante" è affilato e regolare.
Titolo anticorpale del siero da testare:
La diluizione del siero che dà il 50% di agglutinazione rispetto al pozzetto che mostra l'agglutinazione completa (100%) è il titolo anticorpale del siero del test. Sono disponibili kit per l'emoagglutinazione per la rilevazione di anticorpi contro virus dell'epatite B, HIV, tireoglobulina, ecc.
Agglutinazione di particelle di gelatina:
Le particelle di gelatina sono alternative agli eritrociti per i test di agglutinazione di particelle. Particelle di gelatina speciali (circa 3 μm di diametro) hanno una superficie altamente idrofila e quindi non vi è alcun legame non specifico di materiali presenti nel campione. Le particelle di gelatina vengono prodotte per separazione di fase e reticolazione tridimensionale a 40 ° C. Le particelle risultanti sono fissate con formaldeide o gluteraldeide.
Le particelle di gelatina non hanno antigenicità e quindi sono esenti dai problemi associati ai test di emmaglutinazione (come gli anticorpi eterofili, che possono reagire in modo non specifico con i globuli rossi e dare agglutinazioni falsamente positive nei saggi di emoagglutinazione).
Test di agglutinazione al lattice:
Oltre agli eritrociti e alla gelatina, possono essere utilizzate anche poche altre particelle per trasportare antigeni sulla loro superficie. Tali particelle rivestite di antigene si agglutineranno se miscelate con anticorpi specifici. Gli antigeni proteici e polisaccaridici possono essere rivestiti su particelle di lattice. Queste particelle rivestite di antigene si agglutineranno in presenza di anticorpi.
Saggio di emoagglutinazione passiva inversa:
In saggi di emoagglutinazione passiva inversa i globuli rossi sono rivestiti con anticorpi noti. Questi kit sono utilizzati per rilevare gli antigeni nei campioni del test, come HB 's Ag nel siero.
Rose-Waaller Test:
Questo è un test di emoagglutinazione passivo per rilevare il fattore reumatoide. Una delle caratteristiche del fattore reumatoide umano è che può legarsi con IgG umane e IgG di coniglio. Gli eritrociti di pecora sono rivestiti con quantità subagglutinanti di anticorpi IgG anti-pecore (allevati in coniglio). I fattori reumatoidi agglutinano gli eritrociti di pecora rivestiti con IgG di coniglio anti-pecore.
Test di flocculazione:
La flocculazione è un altro tipo di saggio di formazione del complesso antigene-anticorpo, usato per rilevare e quantificare gli anticorpi. Contrariamente all'agglutinazione e alla precipitazione (in cui i complessi antigene-anticorpo si depositano sul fondo della provetta), nel test di flocculazione i complessi antigene-anticorpale si aggregano e rimangono in sospensione sotto forma di flocculi ei risultati vengono letti al microscopio. Questa tecnica è utilizzata nel test VDRL (test di laboratorio di ricerca sulle malattie veneree) per rilevare gli anticorpi contro Treponema pallidum, i batteri che causano la sifilide.
Emoagglutinazione virale:
L'emoagglutinazione virale è una categoria speciale di agglutinazione degli eritrociti, che non coinvolge la reazione antigenica. Alcuni virus si legano alle proteine superficiali dei globuli rossi e questo legame porta all'agglutinazione spontanea dei globuli rossi.
L'agglutinazione spontanea dei globuli rossi da parte di un virus può essere prevenuta da specifici anticorpi anti-virali. Gli anticorpi contro il virus si legano agli antigeni della superficie virale e impediscono l'interazione tra virus e globuli rossi e, di conseguenza, i globuli rossi non sono agglutinati. Si chiama saggio di inibizione dell'emoagglutinazione virale e viene usato per quantificare gli anticorpi virali nel siero dei pazienti.
Test per agglutinine fredde:
Gli anticorpi che si formano durante alcune infezioni (specialmente Mycoplasma pneumoniae) e le malattie autoimmuni hanno una particolare capacità di agglutinare i globuli rossi a 4 ° C. Questi anticorpi sono chiamati agglutinine fredde.
Le diluizioni seriali del siero del paziente vengono incubate con 1% di globuli rossi a 4 ° C durante la notte.
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I tubi sono esaminati per la presenza di agglutinazione. Se è presente agglutinazione, i tubi vengono reincubati a 37 ° C.
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Deagglutinazione di globuli rossi a 37 ° C indica che il siero ha agglutinine fredde. Il saggio di agglutinina a freddo viene utilizzato per diagnosticare l'infezione da Mycoplasma pneumoniae. Il 50-80% dei pazienti con infezione acuta da Mycoplasma pneumoniae ha agglutinina fredda appartenente al tipo IgM.
