Replicazione del DNA: meccanismi di replicazione del DNA

Alcune delle modalità più importanti di replicazione del DNA sono le seguenti!

La replicazione del DNA negli eucarioti è semiconservativa, semi-discontinua e bidirezionale rispetto a quella semiconservativa, bidirezionale e continua nei procarioti.

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La replicazione del DNA si verifica durante la fase S del ciclo cellulare. È un processo complesso a più stadi che richiede oltre una dozzina di enzimi e fattori proteici. Inizia in un punto particolare chiamato origine della replicazione o ori. Il DNA batterico e virale ha un'unica origine di replicazione. Funziona come una singola unità di replica o un replicone.

Nel DNA eucariotico ci sono un certo numero di origini della replicazione. Ha diversi segmenti o repliche replicanti, cioè multiriciclico. In assenza di ori, la replica non si verificherà. Il requisito di un vettore per la tecnologia del DNA ricombinante è quello di ottenere l'origine della replicazione.

La replicazione del DNA è energeticamente molto costosa. L'enzima principale della replicazione del DNA è la DNA polimerasi dipendente dal DNA. La replicazione del DNA è abbastanza rapida. La replicazione del DNA di E. coli con 4, 6 x 10 ⁶ bp richiede 19 minuti.

Su una velocità media di polimerizzazione delle basi è 2000 bp al secondo in ogni direzione. La replicazione richiede un'abbondante energia derivante dalla rottura dei trifosfati di deossiribonucleotidi.

La replica ha luogo come segue:

1. Attivazione di desossiribonucleotidi:

I deossiribonucleotidi oi desossiribonucleosidi monofosfati si verificano liberamente all'interno del nucleoplasma. Sono di quattro tipi: deAMP (deossiadenosina monofosfato), deGMP (deossiguanosina monofosfato), deMP (deossicitidina monofosfato) e deTMP (deossitimidina monofosfato). Vengono prima fosforilati e trasformati in forme attive che hanno tre residui di fosfato invece di uno. Gli enzimi fosforilasi sono richiesti insieme all'energia.

I nucleotidi fosforilati sono deATP (deossiadenosina trifosfato), deGTP (deossiguanosina trifosfato), deCTP (desossicitidina trifosfato) e deTTP (desossitimidina trifosfato). Questi trifosfati di basi hanno un duplice scopo. Fungono da substrato e forniscono energia per la polimerizzazione dei nucleotidi.

2. Esposizione di fili di DNA:

L'enzima enzima (unwindase) agisce sul sito Ori e decomprime (si snoda) i due filamenti del DNA distruggendo i legami idrogeno. I trefoli separati sono stabilizzati mediante proteine ​​a legame singolo (SS BP) o proteine ​​stabilizzanti dell'elica. Lo srotolamento crea tensione nella parte non rivestita formando più supercoil. La tensione viene rilasciata dagli enzimi topoisomerasi.

Causano il nastratura e la richiusura del filamento del DNA. Insieme alla topoisomerasi, i batteri possiedono un altro enzima chiamato DNA girasi che può introdurre supercoil negativi (i lavoratori più anziani ritenevano che la girasi funzionasse sia per l'elicasi che per la topoisomerasi).

Con l'aiuto di vari enzimi, entrambi i filamenti del DNA diventano aperti per la replicazione. Tuttavia, l'intero DNA non si apre in un tratto a causa del fabbisogno energetico molto elevato. Il punto di separazione procede lentamente verso entrambe le direzioni. In ogni direzione, dà l'aspetto della struttura a forma di Y chiamata fork di replica (Fig. 6.13 e 6.14).

3. Primer RNA:

È essenziale per l'avvio di nuove catene di DNA. Primer RNA è un piccolo filamento di RNA che viene sintetizzato all'estremità 5 'del nuovo filamento di DNA con l'aiuto dell'enzima polimerasi RNA DNA specifico chiamato primasi. Il primer RNA è formato sull'estremità libera di un capo e sull'estremità a forchetta dell'altro filo. La formazione del primer RNA costituisce la fase di iniziazione della sintesi del DNA perché senza la presenza di primer RNA, la DNA polimerasi non può aggiungere nucleotidi.

Un enzima più complesso chiamato primo alcuni è richiesto nel fago ф x 174 e in altri sistemi procariotici. Negli eucarioti, la funzione della primasi viene eseguita dall'enzima DNA polimerasi a. Costruisce circa 10 RNA di base e 20-30 basi di DNA (Lewin, 2004). Dopo l'inizio della catena nucleotidica, il primer RNA viene rimosso e il gap viene riempito dalla DNA polimerasi I nei procarioti e DNA polimerasi β negli eucarioti.

4. DNA polimerasi:

I procarioti hanno tre principali tipi di enzimi di sintesi del DNA chiamati DNA polimerasi III, II e I. Tutti loro aggiungono nucleotidi in direzione 5 '-> 3' su 3 '-> 5' tratto di filamento madre. Possiedono anche attività di exo-nucleasi 3 '-> 5'. Mentre la DNA polimerasi III è principalmente coinvolta nella replicazione del DNA (aggiunta e polimerizzazione di nuove basi), la polimerasi I è il principale enzima di riparazione. La polimerasi II è un enzima di riparazione minore.

La DNA polimerasi I ha anche un'attività di esonucleasi 5 -> 3. Negli eucarioti si trovano cinque tipi di DNA polimerasi: α, β, γ, δ e ε, ma i tre maggiori sono α, δ ed e. La polimerasi 8 è coinvolta nella replicazione del filo principale. La polimerasi può aiutare nella sintesi del filamento ritardato insieme ad altri ruoli. La polimerasi a è il più grande e principale enzima di replicazione del DNA. Tutte le DNA polimerasi hanno una configurazione di presa della mano con il pollice su un lato, le dita sull'altro e il palmo come sito catalitico concavo per la combinazione di coppie di modelli e basi.

5. Accoppiamento base:

I due fili di DNA separati nella funzione di fork di replica come modelli. I deossiribonucleosidi trifosfati si trovano di fronte alle basi azotate dei modelli di DNA esposti - deTTP opposto A, deCTP opposto a G, deATP opposto a T e deGTP opposto a C.

L'attacco nucleofilo separa un pirofosfato (PPi) dal trifosfato. I legami di fosfodiester sono stabiliti. L'idrolisi del pirofosfato da parte dell'enzima pirofosfatasi libera energia. Deoxyribouncleoside trifosfato → Deoxyribouncleoside monofosfato + PPi

L'energia viene utilizzata per stabilire legami idrogeno tra i nucleotidi liberi e le basi di azoto dei modelli.

6. Formazione a catena:

Richiede DNA polimerasi III (Kornberg, 1956) nei procarioti e polimerasi δ / ε negli eucarioti. La DNA polimerasi III è un enzima complesso con sette subunità (a, β, ƍ, ƴ, €, θ, τ). In presenza di Mg ²⁺, ATP (GTP), TPP e DNA polimerasi III, i nucleotidi adiacenti trovati attaccati alle basi di azoto di ciascun filamento di DNA del modello stabiliscono legami fosfodiestere e vengono collegati per formare un filamento di DNA replicato.

Con il procedere della replicazione, le nuove aree del DNA genitore duplex si separano e si separano in modo tale che la replicazione proceda rapidamente dal luogo di origine verso l'altra estremità. Il primer dell'RNA viene rimosso e il gap riempito con nucleotidi complementari per mezzo della DNA polimerasi I. A causa dell'apertura sequenziale della doppia catena del DNA e della sua replicazione per formare due catene, la replicazione del DNA viene anche chiamata duplicazione della cerniera.

Tuttavia, la DNA-polimerasi può polimerizzare i nucleotidi solo nella direzione 5 '→ 3' sul filo 3 '-> 5' perché li aggiunge all'estremità 3 '. Poiché i due filamenti del DNA funzionano in direzioni antiparalleli, i due modelli forniscono estremità diverse per la replicazione. La replica sui due modelli procede quindi in direzioni opposte. Un trefolo con polarità У -> 5 'forma continuamente il suo filo complementare perché 3'end di quest'ultimo è sempre aperto per l'allungamento.

È chiamato filo principale. La replica è discontinua sull'altro modello con la polarità 5 '→ 3 perché solo un breve segmento di filamento di DNA può essere costruito in 5' → 3 direzione a causa dell'esposizione di un piccolo tratto di dima in una volta. Brevi segmenti di DNA replicato sono chiamati frammenti di Okazaki (= segmenti di Okasaki, Reiji Okazaki, 1968). Ognuno di loro ha 1000-2000 bp nei procarioti e 100-200 bp negli eucarioti.

Un primer RNA è richiesto anche ogni volta che un nuovo frammento di Okazaki deve essere costruito. Dopo aver sostituito l'innesco di RNA con desossiribonucleotidi e la loro polimerizzazione, i frammenti di Okazaki vengono uniti insieme per mezzo di enzima, DNA ligasi (Khorana, 1967). Il filamento di DNA costituito da frammenti di Okazaki è chiamato filo ritardato.

Man mano che un filamento cresce continuamente mentre l'altro filamento si forma in modo discontinuo, la replicazione del DNA è semi-discontinua. Dal momento che la replica procede in modo bidirezionale dall'origine della replica o ori, un filamento madre formerà un filo principale su un lato e un filo ritardato sull'altro lato. Il rovescio avviene sui fili principali dell'altro lato. Questo aiuta a completare la replica simultaneamente nell'intero replicone.

7. Revisione delle prove e riparazione del DNA:

A volte viene introdotta una base errata durante la replica. La frequenza è uno su diecimila. La DNA polimerasi III è in grado di percepire la stessa cosa. Torna indietro, rimuove la base errata, consente l'aggiunta della base corretta e procede in avanti. Tuttavia, anche la DNA polimerasi III non è in grado di distinguere l'uracile dalla timina in modo che venga spesso incorporato al posto della timina. Tale discrepanza viene corretta per mezzo di un numero di enzimi.

Esiste un meccanismo di riparazione separato per qualsiasi danno causato al DNA a causa di mutazione, esposizione ai raggi UV o disallineamento che sfugge al meccanismo di correzione delle bozze. Un nick o una rottura è causato da un'endonucleasi vicino alla regione di riparazione. La DNA polimerasi I (Komberg, 1969) rimuove i nucleotidi non corrispondenti o errati se presenti e sintetizza una corretta sostituzione usando il filamento intatto come modello. Il segmento appena formato è sigillato dalla DNA ligasi.